Lo sviluppo delle nanotecnologie e il crescente impiego di materiali a struttura nanometrica nei prodotti di consumo (vernici, cosmetici, tessuti, ecc.), aprono nuovi scenari sul loro destino ambientale ed impongono una valutazione dei loro effetti sugli organismi viventi e sulle dinamiche naturali. Poiché è ormai abbastanza chiaro che i saggi ecotossicologici utilizzati per le sostanze chimiche non sembrano efficaci nel valutare la tossicità dei nanomateriali c’è una crescente richiesta di nuovi metodi e strumenti per valutare la potenziale tossicità di questa nuova generazione di contaminanti. In particolare, risulta cruciale l’identificazione di nuovi approcci in grado di risolvere le problematiche tipiche della nanotossicologia, legate alle caratteristiche intrinseche delle nanoparticelle, le cui dinamiche fisiche e chimiche in natura non sono paragonabili a quelle delle controparti micrometriche. Questa ricerca si inserisce nell’ambito dell’adeguamento e dell’ottimizzazione di protocolli per la valutazione dell’ecotossicità dei nanomateriali (di interesse comunitario), con particolare attenzione agli ambienti marini. Utilizzando un ceppo di microrganismi di ambiente marino e salmastro, Vibrio anguillarum, è stato messo a punto un nuovo saggio in grado di valutare l’ecotossicità dei nanomateriali, oltre quella di contaminanti convenzionali. Questo nuovo protocollo permette la determinazione della tossicità acuta, la CL₅₀, cioè la concentrazione che provoca una diminuzione del 50% della coltivabilità batterica, dopo un'esposizione 6 ore. La novità di questo protocollo, rispetto agli altri metodi attualmente utilizzati con i microrganismi è principalmente legata al mezzo di esposizione, una soluzione salina, che evita le possibili interferenze tra mezzi di crescita e contaminanti. É noto infatti che le interferenze mezzo di crescita/contaminante possono influenzare la risposta biologica. Inoltre, la possibilità di effettuare il test a diverse salinità permette di valutare anche la tossicità delle nanoparticelle a diverse salinità, parametro ambientale in grado di influenzarne significativamente la tossicità. Questo lavoro è un punto di partenza per lo studio della tossicità delle nanoparticelle sugli organismi marini, è supportato dal programma di ricerca “NanoBioTech Ambiente e Salute” (finanziato da Regione Lazio e Consorzio Hypazia) e include uno specifico accordo di progetto con l’ISPRA. Il lavoro è stato svolto in collaborazione con lo staff del Consorzio Hypazia, in particolare con Flavio Lucibello, presidente del Consorzio, con il gruppo NEXT (NanosciencE eXperiment for Technology) dell’INFN-LNF e con Loredana Manfra e Marco Pisapia dell’ISPRA. Visto l’interesse il protocollo è stato pubblicato come video per permetterne una più facile fruizione dai laboratori che la dovranno applicare.

Rotini A., Manfra L., Spanu F., Pisapia M., Cicero A.M., Migliore L. (2017) - ECOTOXICOLOGICAL METHOD WITH MARINE BACTERIA VIBRIO ANGUILLARUM TO EVALUATE THE ACUTE TOXICITY OF ENVIRONMENTAL CONTAMINANTS. Journal of Visualized Experiments, 123: e55211. DOI: 10.3791/55211

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC₅₀, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6-h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the “mortality” is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO₄) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC₅₀ of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC₅₀ calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.